Bestimmung von bakteriellem Wachstum und Proteingehalt mit dem fluidlab R-300

Einleitung

Die biochemische Analyse der Funktion und Leistung von Proteinen ist ein grundlegender Forschungsschritt auf dem Weg zur industriellen Nutzung von z.B. Enzymen, die zur Senkung des Energieverbrauchs von Industrieprozessen oder zur Erleichterung komplizierter chemischer Änderungen eingesetzt werden. Dafür ist die rekombinante Expression von Proteinen in bakterieller Zellkultur eine wichtige Aufgabe im Labor, die es dem Anwender ermöglicht, Enzyme durch Protein-Engineering in großen Mengen herzustellen. Hier zeigen wir, dass die Verwendung des fluidlab R-300 dem Anwender die vollständige Qualitätskontrolle von Expressionssystemen, unter Verwendung eines einzigen tragbaren Gerätes, ermöglicht. Dazu gehört die genaue Beurteilung der Bakterienwachstumskurve durch OD600-Streulichtmessungen sowie die kolorimetrische Bestimmung der Proteinausbeute mit dem Bradford-Assay. Das fluidlab R-300 kann leicht verwendet werden, um zum einen Standardparameter in Screening-Experimenten festzulegen und zum anderen, um die ermittelten Parameter direkt in der Produktion einzusetzen, ohne Verwendung eines anderen Methodentransferschritts.

Material und Methoden

Lemo21 E. coli Zellen wurden mit einem pLEMO-Plasmid transformiert, das eine Chloramphenicol Resistenzkassette für negative Selektion, sowie das Gen für das jeweilige Protein, welches von einem upstream Lac-Operon reguliert wird, beinhaltet. Als Modellenzym wurde ein Cytochrom-P450-Enzym gewählt, da dieses interessante katalytische Möglichkeiten für die Hydroxylierung von aromatischen Verbindungen bietet. Um eine hohe Expressionsrate zu erreichen, wurden FeCl3 und δ-Aminolävulinsäure zum LB-Nährmedium hinzugefügt, sodass die korrekte Inkorporation der Häm-Gruppen zur Bildung des Holo-Komplexes sichergestellt wurde.

 

Wachstumskurve

Die E.coli-Wachstumskurve wurde bei 37°C unter ständigem Schütteln über einen Zeitraum von 90 Stunden überwacht, nachdem eine Beimpfung mit einer Vorkultur über Nacht stattgefunden hat. Der Versuch fand unter Verwendung des fluidlab Streulichtadapters (Nr. 03) statt. Die Messung wurde bei einer festen Wellenlänge von 600 nm durchgeführt. Aus Vorversuchen war bekannt, dass die lineare Phase bei OD 0,3 beginnt, sodass zu diesem Zeitpunkt die Proteinexpression durch IPTG Induktion getriggert wurde.

 

Kalibrierkurve, Zelllyse und Bestimmung der Proteinmenge

Zur Bestimmung der Gesamtproteinexpression wurde eine Kalibrierkurve mit Rinderserum-Albumin (BSA, Sigma Merck, Deutschland) und einer gebrauchsfertigen Bradford-Lösung (Sigma Merck, Deutschland) erstellt. Um die Zellen zu lysieren, wurden diese in Triton-X Puffer inkubiert, um die Zellmembranen aufzulösen, und anschließend sonifiziert. Der Überstand wurde dann kontinuierlich mit dem fluidlab R-300 Spektrometer gemessen, um die Proteinausbeute und die korrekte Inkorporation der Häm-Proteine zu analysieren.

Ergebnisse

Wachstumskurve

Die Wachstumskurve ist in Abbildung 1 dargestellt und zeigt ein solides, lineares Wachstumsverhalten bis zu einer OD von etwa 0,8, bei dem das System in die Sättigung konvergiert.

E. Coli-Wachstumskurve (Innokulation von IPTG bei einer Extinktion von 0,3)

Abbildung 1: Wachstumskurve von E. Coli (Impfung von IPTG bei einer Extinktion von 0,3)

Kalibrierkurve

Eine Standardkurve wurde mit der geräteinternen Anwendung "Kalibrierungskurve" unter Verwendung von BSA und nach den Anweisungen des Herstellers zur Erstellung der Standardkurve berechnet. Es ergab sich ein R2 von 0,98 (Abbildung 2).

Bestimmung der Proteinkonzentration

Die Proteinkonzentration des Zelllysats wurde mit dem fluidlab R-300 basierend auf der Kalibrierkurve in Triplikaten ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Sowohl für die Bestimmung der Extinktion als auch der Konzentration konnte eine hohe statistische Sicherheit erreicht werden, welche sich in niedrigen Variationskoeffizienten (%CV) von 1% (Extinktion) und 2% (Konzentration) wiederspiegelt.

Spektrophotometrische Beobachtung der Häm-Inkorporation

Das Spektrum des Überstands zeigte das typische Maximum bei 421 nm, sowie zwei kleinere Peaks bei 575 nm und 600 nm, welche potenziell auf Zelldebris oder fehlerhafte Inkorporation der Häm- Gruppen oder anderer Metallionen zurückzuführen sind (Abbildung 4).

Berechnung der Häm-Belegung

Aus früheren Experimenten sind die molaren Extinktionskoeffizienten der Häm-Einheiten bekannt, so dass das Molverhältnis

𝜒 =𝑐(ℎ𝑒𝑚𝑒)/𝑐(𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛)= 23%

bestimmt werden konnte.

Diskussion

Die Proteinexpression aus heterologen Systemen, wie E. coli, ist ein wichtiges Werkzeug in vielen Forschungsbereichen. Diese Studie belegt, dass die vollständige Qualitätsbewertung einer P450-Enzymexpression mit dem fluidlab R-300 durchgeführt werden konnte. Mit diesem Gerät und mit Standard-Chemikalien konnten sowohl die Reinheit als auch die Inkorporations-Effizienz der Häm-Gruppen des produzierten Enzyms gemessen werden, welche nur 23% betrug. Um diesen Wert weiter zu bewerten, sollten die folgenden drei Maßnahmen ergriffen werden. Erstens war die exprimierte P450-Oxidoreduktase nur ein Bruchteil des gesamten Pools an Peptiden, der durch das Bradford-Assay bestimmt wurde. Diese Fraktion sollte entweder mittels SDS-PAGE oder sogar massenspektrometrischer Analyse bestimmt werden. Zweitens wurde das Zelllysat nicht zentrifugiert, was zu hohen Verunreinigungen führte, die im Spektrum als Peak nahe des UV-Bereichs sichtbar sind und neben den Peaks der eigentlich hämhaltigen Fraktionen liegen. Schließlich sollte die Aufnahme von FeCl3 und δ Aminolävulinsäure durch bakterielle Zellen entweder möglichst überwacht oder zumindest variiert werden, um die Häm-Inkorporation durch Verschiebung des Enzyms zu den gewünschten Fraktionen zu verbessern. Die Überwachung könnte wieder durch Photospektrometrie durchgeführt werden, z.B. unter Verwendung des Chelatbildners Ferrozin zur kolorimetrische Bestimmung. Alle Schritte dieser Qualitätsbewertung wurden mit einem tragbaren Spektralphotometer durchgeführt, welches die Qualitätskontrolle, z.B. in der Produktionsumgebung, direkt und ohne Methodentransfer auf ein anderes analytisches System, ermöglicht.