Antikörper sind Proteine, die von B-Zellen des Immunsystems als Reaktion auf Antigene gebildet werden und daher ein wichtiger Bestandteil des Immunsystems. Antigene sind molekulare Strukturen, die vom Körper als fremd erkannt werden und an die Antikörper binden können. Dabei kann es sich beispielsweise um Proteine auf Zelloberflächen von Pilzen, Viren oder Bakterien handeln. Dadurch werden die Krankheitserreger vom Immunsystem erkannt und können unschädlich gemacht werden. Monoklonale Antikörper werden aus nur einem Zellklon hergestellt, welcher einem einzigen B-Lymphozyten entsprungen ist. Sie sind dafür bekannt, dass sie sich gegen ein einzelnes Epitop richten, weshalb sie eine besonders hohe Spezifität aufweisen. Aufgrund der Möglichkeit einer kontinuierlichen Kultur von Hybridomazellen, welche monoklonale Antikörper produzieren, kann außerdem eine unbegrenzte Verfügbarkeit der monoklonalen Antikörper gewährleistet werden.
Die Entwicklung der monoklonalen Antikörperproduktion war ein Meilenstein für die Wissenschaft und Medizin, wodurch sich neue Möglichkeiten für Krebstherapien, aber auch therapeutische Wirkstoffe für Entzündungskrankheiten ergaben. Zudem werden sie zum Nachweis und zur Identifizierung von Serumanalyten, Zellmarkern und Krankheitserregern genutzt.1
Antikörper können somit vielseitig in verschiedenen Bereichen eingesetzt werden, weshalb ihre Herstellung von großer Bedeutung für die Medizin und Forschung ist. Das fluidlab R-300, eine Kombination aus einem Spektrometer und einen automatischen Zellzähler, kann im Bereich der Forschung und Entwicklung die Produktion von monoklonalen Antikörpern unterstützen.
Erfahren Sie in diesem Artikel mehr über
- die Struktur, Form, Kategorien und Funktion von Antikörpern bei der Immunantwort,
- passive und aktive Immunisierung,
- die Entstehung von monoklonalen Antikörpern und wie diese sich von polyklonalen Antikörpern unterscheiden,
- Verfahren zur Generierung von Antikörpern und dem Herstellungsprinzip nach Milstein und Köhler,
- die Bedeutung von Antikörpern für die Forschung sowie
- die Vorteile des Einsatzes des fluidlab R-300 bei der Antikörperproduktion.
Testen Sie das fluidlab R-300 kostenfrei und unverbindlich!
Sie möchten Ihren Laboralltag noch effizienter gestalten oder Analysen ortsunabhängig ausführen und sind an innovativer Technologie interessiert, die sich genau das zum Ziel gesetzt hat? Dann testen Sie jetzt unser patentiertes fluidlab R-300 – ganz unverbindlich!
Jetzt Testgerät anfordern
Antikörper sind maßgebende Proteine für die Immunantwort
Bei Antikörpern handelt es sich um Effektormoleküle, die zur humoralen Immunantwort gehören. Es gibt fünf Klassen von Antikörpern, welche sich unter anderem durch ihre Größe, Form oder ihr Gewicht unterscheiden. Ihre Hauptfunktion ist die Markierung von Pathogenen (Opsonierung) bzw. die Neutralisation von Antigenen.
Struktur, Form und Kategorien von Antikörpern
Die fünf verschiedenen Klassen der Antikörper oder auch Immunglobuline (Ig) haben gemeinsam, dass sie aus zwei schweren und zwei leichten Ketten bestehen. Die schwere Kette trägt einen griechischen Buchstaben als Namen und ist auch für das jeweilige Immunglobulin namensgebend. Bei den fünf Antikörperklassen handelt es sich um IgM, IgE, IgD, IgG und IgA. Die zwei leichten Polypeptidketten bestehen aus jeweils 220 und die beiden schweren aus jeweils 450 Aminosäuren. Die Ketten sind über Disulfidbrücken miteinander verbunden (Abb. 1).
Abb. 1 Aufbau der Antikörperklassen IgG, IgE, IgD, IgM und IgA
Beim inneren Bereich des „Y“ handelt es sich um die lange, schwere Kette, während der äußere Bereich der beiden Arme die leichten Ketten sind. Der Anfangsteil der leichten Kette sowie der schweren – also der Anfangsteil der Y-Arme – ist variabel und ausschlaggebend für die Spezifität des Antikörpers für verschiedene Antigene. Die Y-Form ergibt sich durch das Abknicken der schweren Ketten in der Mitte und ist typisch für Immunglobulin A, D, G und E (Abb. 1).
Das IgM-Molekül unterscheidet sich optisch von den anderen, da es aus fünf Grundeinheiten aus jeweils zwei leichten und schweren Ketten besteht, sodass sich ein Pentamer und somit ein fünfstrahliger Seestern ergibt. Innerhalb der Klasse IgA sind zwei Einheiten in der Lage sich über ein unspezifisches Transportstück zu einer größeren Einheit zu verbinden (Abb. 1). Dies macht sie resistenter gegen fermentativen Abbau. 2
Die Unterschiede zwischen den einzelnen Antikörperklassen sind in der folgenden Tabelle (Tab. 1) zusammengefasst.
Tab. 1 Unterschiede zwischen den verschiedenen Antikörperklassen in Molekülmasse (kDA), Plasmakonzentration (g/L), schwere Kette, leichte Kette, ihrem Vorkommen im Organismus und ihrer jeweiligen Hauptfunktion. 2
| Kategorie | IgM | IgE | IgD | IgA | IgG |
|---|---|---|---|---|---|
| Molekülmasse (kDa) | 900 | 200 | 180 | 150 (Dimer 400) | 150 |
| Plasmakonzentration (g/L) | 1,5 | 0,00005 | 0,03 | 3,5 | 13,5 |
| schwere Kette | γ | ε | δ | α | γ |
| leichte Kette | κ oder λ | κ oder λ | κ oder λ | κ oder λ | κ oder λ |
| Vorkommen | Oberfläche von B-Zellen, Blutserum | Zellmembran von Mastzellen und Granulozyten | Oberfläche von B-Zellen | Schleimhäute, Muttermilch | Schleimhäute, Blutserum |
| Hauptfunktionen | erste Abwehr gegen Mikroorganismen im Blut | Parasitenabwehr, Bewirkung anaphylaktische Reaktion | Aufbau B-Zell-Rezeptor, Beeinflussung Lymphozyten | Schleimhautschutz, Schutz von Neugeborenen | Schutz extravaskulärer Raum vor Bakterien und Viren, Nestschutz von Neugeborenen |
Die Funktion von Antikörpern bei der Immunantwort
Antikörper haben vor allem die Aufgabe, Krankheitserreger zu erkennen, zu markieren und zu neutralisieren. Markiert werden die Antigene durch spezifische Bindungen der Antikörper (Abb. 2), wodurch sie für Immunzellen und die Komplementproteine für die Phagozytose sowie für zytotoxische und lytische Reaktionen kenntlich gemacht werden. Die einzelnen Funktionen der unterschiedlichen Klassen lassen sich wiederum genauer differenzieren (Tab. 1).
Abb. 2 Antikörper erkennen eine körperfremde Blutzelle, binden daran und können so eine Immunantwort auslösen.
IgM
IgM ist v.a. in der frühen Phase einer Infektion vorherrschend und hauptsächlich gegen eindringende Mikroorganismen aktiv. Die Produktion des Antikörpers erfolgt in der Regel zwei bis drei Tage nach dem Erstkontakt mit dem Antigen. Membrangebunden auf B-Zellen-Oberflächen, übernimmt es die Funktion eines Antigenrezeptors.
IgG
IgG ist hingegen bei einer wiederholten Infektion mit dem gleichen Antigen wichtig und somit der wichtigste Antikörper der sekundären Immunantwort. Dieser Antikörper tritt mit der höchsten Konzentration im Körper auf. Sowohl IgM als auch IgG aktivieren das Komplementsystem, eine Proteinkaskade aus über 20 im Blut zirkulierenden Komponenten und Regulatoren, deren Hauptaufgabe die Zerstörung und Opsonierung von Erregern und Fremdkörpern sowie die Aktivierung von Abwehrzellen ist. Zusätzlich bindet IgG an entsprechende Rezeptoren auf Monozyten, Makrophagen und Granulozyten, wodurch die Phagozytose des gebundenen Antigens begünstigt wird.
Außerdem handelt es sich bei IgG um den einzigen Antikörper, der die Plazentaschranke mittels rezeptorvermittelter Endozytose passieren kann. Dies hat zur Folge, dass die passive Immunität von der Mutter auf den Fötus übertragen wird. Zwei Tage nach dem ersten Auftreten von IgM erfolgt die Produktion von IgG.
IgA
IgA ist die erste Abwehrlinie bei der lokalen Infektabwehr und liegt hauptsächlich im Verdauungstrakt sowie in Körperflüssigkeiten vor. Durch den Antikörper kommt es zur Verhinderung des Anheftens von Viren und Bakterien an den Oberflächen von Epithelien. IgA in der Milch einer stillenden Mutter dient zusätzlich dem Schutz des Säuglings vor dem Eindringen von Krankheitserregern in den Darm.
IgD
IgD liegt im Vergleich zu den anderen Antikörpernklassen nur in einer sehr geringen Konzentration im Blut vor. Es fungiert als Antigenrezeptor membranständig auf B-Zellen und ist essenziell für die Differenzierung von B-Zellen zu Plasma- und B-Gedächtniszellen.
IgE
IgE ist für die Auslösung allergischer Reaktionen notwendig und besitzt eine Schutzfunktion gegen Parasiten. 3
Passive vs. aktive Immunisierung
Sowohl eine passive als auch eine aktive Immunisierung sorgen dafür, dass der Organismus immun gegen bestimmte Erreger wird. Allerdings unterscheiden sich diese beiden Arten der Immunisierung in mehreren Punkten voneinander. Bei der passiven Immunisierung werden Antikörper, welche zuvor aus einer bereits immunen Person isoliert wurden, in eine andere, nicht immune Person injiziert (Abb. 3).
Abb. 3 Person 1 wird durch einen abgeschwächten Erreger aktiv gegen diesen immunisiert und bildet Antikörper. Diese werden entnommen und für die passive Immunisierung, einer mit dem Erreger infizierten Person, injiziert. Es kommt bei der Person anschließend zu keiner eigenen Antikörperproduktion und somit auch zu keiner anhaltenden Immunität.
Die passive Immunisierung erfolgt, wenn sich eine nicht immune Person bereits mit dem Krankheitserreger infiziert hat und es dadurch zu spät für eine aktive Immunisierung ist. Bei der immunen Person, aus der die Antikörper isoliert werden, kann es sich um jemanden handeln, der die Infektion mit dem Krankheitserreger bereits überstanden und in diesem Zuge eigene Antikörper gebildet hat oder aber zuvor aktiv immunisiert wurde.
Der Vorteil der passiven Immunisierung ist, dass die Antikörper unmittelbar nach der Impfung wirkungsvoll sind und den Krankheitserreger schnell außer Gefecht setzen. Allerdings kommt es innerhalb von max. drei Monaten zum Abbau dieser Antikörper vom Organismus, da sie nicht vom Organismus selbst produziert wurden und somit als Fremdkörper angesehen werden. Aus diesem Grund hält der Impfschutz auch nur für diese Zeit, denn es kommt nach der passiven Immunisierung nicht zur eigenen Antikörperproduktion.
Im Gegensatz hierzu kommt es bei der aktiven Immunisierung zur gezielten Infizierung des Organismus mit dem abgeschwächten Krankheitserreger, was die eigene Antikörperproduktion zufolge hat (Abb. 4).
Der Prozess der körpereigenen Antikörperproduktion gegen einen bestimmten Krankheitserreger kann im Schnitt bis zu zwei Wochen dauern, somit sind die Antikörper bei der aktiven Immunisierung deutlich später aktiv als bei der passiven. Die aktiv gebildeten Antikörper können im Körper allerdings über viele Jahre hinweg verweilen und sind somit auch noch lange gegen den Krankheitserreger wirksam. Grund hierfür ist die Ausbildung von B-Lymphozyten, auch Gedächtniszellen genannt. Dadurch kommt es bei erneuter Infektion mit dem Erreger zu einer Nachproduktion der benötigten Antikörper. Es wird demnach ein antigenspezifisches Immungedächtnis aufgebaut.
Die Krankheitserreger in Impfungen werden vor der Verabreichung entweder abgeschwächt oder vollständig abgetötet. Zudem kommt es vor, dass lediglich charakteristische Merkmale des Erregers verimpft werden. Beispiele für die aktive Immunisierung sind u.a. die Vakzine gegen Tetanus, Masern oder Mumps. 4
Abb. 4 Eine gesunde Person wird durch die Injektion eines abgeschwächten Erregers aktiv immunisiert (Impfung). Im Zuge dessen bildet diese Antikörper aus, welche länger im Körper zirkulieren. Dadurch ist sie gegen den Erreger immun und bei erneutem Kontakt kann direkt eine Immunantwort ausgelöst werden.
Die Entstehung von monoklonalen Antikörpern
1975 erfolgte eine revolutionäre Methode zur Produktion monoklonaler Antikörper durch Köhler und Milstein. Hierfür erhielten beide Wissenschaftler im Jahr 1984 den Nobelpreis für Medizin.5
Monoklonale Antikörper richten sich nur gegen eine antigene Determinante des zur Immunisierung benötigten Materials. Sie werden lediglich durch einen einzigen B-Lymphozyten-Klon produziert. Die gezielte Herstellung von monoklonalen Antikörpern erfolgt durch die Hybridomtechnik. Dieser liegt die Kultur und Klonierung einer einzigen Antikörper-produzierenden B-Lymphozyte zugrunde. Dadurch können identische und somit monoklonale Antikörper in großen Mengen erzeugt werden.
Im Normalfall überleben B-Lymphozyten in Kultur nur für eine kurze Zeit. Aus diesem Grund werden bei dieser Technik einzelne Antikörper-produzierende B-Lymphozyten mit Zellen eines uneingeschränkt teilungsfähigen Myeloms fusioniert. Die B-Lymphozyten stammen aus einer Maus, welche gegen ein spezifisches Antigen immunisiert ist. Auf diese Weise entstehen Hybridzellen, die sogenannten Hybridomzellen. Mithilfe spezieller Selektionsmedien erfolgt dann die Auslese dieser Hybridzellen, welche zum einen den gewünschten Antikörper produzieren und sich zum anderen unendlich oft teilen können. Aus jeder solchen Hybridomzelle geht somit ein individueller Zellklon hervor, welcher uneingeschränkt wächst und dabei den bestimmten (monoklonalen) Antikörper herstellt.6
Eingesetzt werden monoklonale Antikörper vor allem als analytische Reagenzien in der Diagnostik, in der Forschung und Therapieansätzen.
Die erste funktionierende Serumtherapie, welche von Antikörpern Gebrauch machte, wurde 1891 von Emil von Behring und Erich Wernicke entwickelt. Die Forscher hatten gemeinsam mit Shibasaburo Kitasato den tetanusbildenden Bazillus isoliert und rückgeschlossen, dass die pathogene Wirkung auf der Freisetzung eines Toxins beruhte. Daraufhin folgte eine Übertragung des Blutserums eines mit Diphterietoxin immunisierten Meerschweinchens auf ein anderes Meerschweinchen. Als Folge dessen wurde eine Immunität des zweiten Meerschweinchens gegenüber dem Toxin festgestellt. Nach zahlreichen klinischen Tests kam das erste immunbiologische Therapeutikum schließlich drei Jahre später als Anti-Diphterie-Serum auf den Markt.7
Monoklonale vs. Polyklonale Antikörper
Im Gegensatz zu monoklonalen Antikörpern, erfolgt die Entstehung von polyklonalen Antikörpern bei einer natürlich ablaufenden Immunreaktion des Körpers. Die so entstandenen Antikörper unterscheiden sich in vielen Punkten von den monoklonalen.
Es handelt sich bei ihnen um das Erzeugnis von B-Zellen mehrerer Zellklone. Sie erkennen unterschiedliche Strukturen des Zielantigens. Außerdem können dessen Spezifität sowie die Affinität variieren. Nachdem ein Individuum immunisiert worden ist, muss eine Aufreinigung der polyklonalen Antikörper stattfinden, bevor diese für die Immunisierung verwendet werden können.
Monoklonale Antikörper hingegen entstehen, wie bereits im vorherigen Abschnitt erwähnt, aus Hybridomzellen, einer Fusionierung aus einer B-Zelle und einer Myelom-Zelle, welche im Labor künstlich zu einer spezifischen Zelllinie geklont wurden.
Die Struktur von monoklonalen Antikörpern variiert daher nicht und sie binden nur ein bestimmtes Antigen an einer spezifischen Stelle. Somit richten sie sich gegen eine einzige antigene Determinante.
Gegenüber polyklonalen Antikörpern weist die Verwendung von monoklonalen Antikörpern deutliche Vorteile auf. So kommt es zu weniger Kreuzreaktionen von monoklonalen Antikörpern, was ihre Spezifität erhöht, da sie sich jeweils nur gegen ein spezifisches Antigen richten. Zudem erfolgt ihre Herstellung in großen Mengen und ist von konstanter Qualität. Zusätzlich können monoklonale Antikörper leichter aufgereinigt werden als polyklonale Antikörper. 8
Verfahren zur Generierung von monoklonalen Antikörpern
Für die Generierung von monoklonalen Antikörpern gibt es verschiedene Verfahren. Grundsätzlich geht es darum, Zellen dazu zu bringen, die gewünschten Antikörper zu produzieren. Milstein und Köhler waren dabei die ersten Wissenschaftler, welche ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper entwickelt haben. Dies gelang ihnen mithilfe von Hybridomzellen.
Einsatz von lebenden Organismen: Das Herstellungsprinzip nach Milstein und Köhler
Die Herstellung von monoklonalen Antikörpern nach Milstein und Köhler beginnt allgemein mit der Erzeugung der Hybridzellen durch die Fusionierung von Myelomzellen und Antikörper-produzierenden B-Zellen. Im Herstellungsprinzip werden folgende Schritte durchlaufen.
- Immunisierung der Mäuse und Isolation der Antikörper-produzierenden Splenozyten (hier B-Zellen)
Nach der Immunisierung der Mäuse mit einem Antigen, erfolgt ein Screening des Bluts zur Überprüfung der Produktion von Antikörpern. Anschließend erfolgt die Isolierung von Antikörper-produzierenden Splenozyten. - Aufbereitung der Myelomzellen
Myelomzellen werden für die Vermischung mit den Splenozyten vorbereitet, um im nächsten Schritt ein Hybridom mit unbegrenztem Wachstumspotential zu bilden. - Fusion der Myelomzellen und isolierten Splenozyten
Hierbei erfolgt die Fusion der Myelomzellen mit den isolierten Antikörper-produzierenden Zellen, wodurch Hybridome gebildet werden. Verwendet wird hierfür Polyethylenglycol, wodurch eine Fusion der Zellmembran erzeugt wird. - Screening und Selektion der Klone
Angesichts ihrer Antigenspezifität und Immunglobulinklasse erfolgt ein Screening sowie eine Selektion der Klone. - Funktionelle Charakterisierung
Mittels eines Antikörper-Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) werden stark sezernierende Kolonien bestätigt sowie validiert und charakterisiert. - Scale-up und Entwöhnung
Im vorletzten Schritt werden die Klone, welche die angestrebten Antikörper herstellen, im großen Maßstab produziert und vom Selektionsmedium entwöhnt. - Expansion
Als letztes erfolgt die Expansion der Klone, welche die gewollten Antikörper produzieren, zum Beispiel in Bioreaktoren. 6
Die Verwendung von Vektoren zur Produktion monoklonaler Antikörper
Mittlerweile gibt es abgesehen von der Hybridom Technik auch weitere Methoden, um monoklonale Antikörper, vor allem im großen Maßstab, herzustellen. Dabei werden im ersten Produktionsschritt Vektoren, welche die Ziel-DNA beinhalten, hergestellt. Zur Herstellung therapeutischer monoklonaler Antikörper werden meistens Glutamin-Synthetase (GS) Gen Expressionssysteme und solche, die auf Dihydrofolat-Reduktase (DHFR) basieren, verwendet.
Die hergestellten Vektoren werden in Bakterien, wie zum Beispiel Escherichia coli, vermehrt und anschließend in Zellen transfiziert. Es handelt sich dabei meistens um CHO-, HEK-, Sf9- oder HeLa-Zellen. In einigen Expressionssystemen werden allerdings auch Hefezellen verwendet. Im Anschluss erfolgt das Screening der Zellen, um die erfolgreich transfizierten Zellen, welche die Antikörper produzieren, zu selektieren. Zum Schluss erfolgt das Scale-up und die Expansion in große Bioreaktoren, wo die Antikörper mittels des Fed-Batch Verfahrens im großen Maßstab hergestellt werden.9
Alternative In-vitro-Technologien zur Produktion von monoklonalen Antikörpern
Monoklonale Antikörper können aber auch auf andere Weise als der zuvor beschriebenen produziert werden. Eine Möglichkeit ist das Phagen-Display 10, bei dem es unter anderem darum geht, bestimmte Strukturen wie Antigene auf Zelloberflächen zu präsentieren und bei Antikörper-Banken zu verwenden. In diesen Banken befinden sich viele unterschiedliche Genabschnitte für Antikörper. Jede Phage beinhaltet hierbei eine andere Sequenz für Antikörper.
Abb. 5 Das Zielprotein wird in die Hülle der Phagen eingebaut. Bei der Präsentation des passenden Liganden, können Phagen mit dem Zielprotein daran binden und so selektiert werden.
Bei einem Phagen-Display erfolgt zunächst die Isolierung von Plasmazellen aus dem Organismus, aus denen die mRNA isoliert und in cDNA transkribiert wird. Die in der cDNA enthaltenen Gene werden dann über eine Polymerase Kettenreaktion (PCR) vervielfältigt.
Durch die Integration der Gensegmente in ein Phagemid-Vektor und die darauffolgende Übertragung in E.coli, kommt es zur Expression von Fusionsproteinen, die ins Periplasma transportiert und dort zu Hüllproteinen modifiziert werden.
Die entstandenen Proteine werden bei der Neubildung in die Hülle der Phagen eingebaut, wo sie die Funktion einer Bindungsstelle für Antigene Liganden erfüllen (Abb. 5). Durch die Einführung spezieller Liganden, an denen die Phagen mit den Zielproteinen binden, können die Phagen isoliert werden. Diese Schritte können wiederholt werden, bis das Zielprotein in der gewünschten Konzentration vorliegt. 11
Die Bedeutung von monoklonalen Antikörpern in der Forschung
Der Einsatz von monoklonalen Antikörpern ist sehr vielfältig, was sie äußerst bedeutend für die Forschung macht. Abhängig von ihrer spezifischen Wirkung können sie daher unterschiedlich eingesetzt werden. Während einige gegen antimikrobielle Peptide, sogenannte lösliche Faktoren12, gerichtet sind und die Aufgabe haben, diese zu neutralisieren, gibt es wiederum andere, welche sich gegen Rezeptoren richten. Die dadurch entstehende Blockierung des Rezeptors hat zur Folge, dass die durch den natürlichen Liganden induzierte Signalkaskade inhibiert wird.
Einsatz in der Medizin
Antikörper kommen auch bei der Entwicklung von Wirkstoffen und Pharmaka zum Einsatz. Ein Beispiel hierfür ist der Wirkstoff Nivolumab, wohinter sich ein monoklonaler Antikörper verbirgt, welcher gezielt gegen den fortgeschrittenen nicht-kleinzelligen Bronchialkrebs eingesetzt werden kann und so zu einer starken Verbesserung des gesundheitlichen Zustands der PatientInnen führt.
Weiterhin werden sie zur Entwicklung von Medikamenten eingesetzt, die Botenstoffe binden können.
Das Medikament Infliximab bindet zum Beispiel einen Botenstoff namens TNF-alpha, wodurch es seine biologische Wirkung als Entzündungsfaktor neutralisiert. Aus diesem Grund wird er bei der Behandlung verschiedener Entzündungskrankheiten wie Morbus Crohn, rheumatoide Arthritis, Morbus Bechterew, Psoriasis oder auch Colitis ulcerosa eingesetzt.
Ebenfalls zur Behandlung von nicht-kleinzelligem Bronchialkrebs wird der Wirkstoff Bevacizumab eingesetzt. Seine Wirkung liegt in der Bindung vom Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), welches als Botenstoff bei der Angiogenese fungiert. Bei der Tumorangiogenese werden Botenstoffe vom Karzinom gesendet, welche die Angiogenese, die Ausbildung neuer Blutgefäße, in Richtung des Tumors begünstigen und ihm so Anschluss an das Blutgefäßsystem zum Wachsen ermöglichen. 13
Einsatz in der Diagnostik
Antikörper können bei der Diagnose und Therapie von Tumorerkrankungen eine maßgebende Rolle spielen. In der pathologischen Diagnostik kann mithilfe eines histologischen Bildes, klinischen Angaben und einer Anamnese durch wenige, aber höchst spezifische Antikörper einer erkrankten Person eine sehr genaue Diagnose gestellt werden.
Das Verfahren erfolgt meistens an einem Paraffinschnitt mit möglichst viel vitalem und repräsentativen Tumorgewebe. Nach entsprechender Vorbereitung des Gewebes, erfolgt die Markierung mit einem passenden Antikörper. Es wird zunächst ein Primärantikörper verwendet, welcher spezifisch an der vorgesehenen Bindungsstelle im Gewebe bindet. Anschließend folgt die Zugabe eines Sekundärantikörpers, der an ein Polymer gekoppelt ist und am Primärantikörper bindet.
Durch den zweiten Antikörper bzw. die Kopplung mit dem Polymer, lassen sich die Antikörper detektieren. Mithilfe der passenden Antikörper lässt sich die Entität und Subtypisierung eines Tumors bestimmen. Im Falle einer Metastase lässt sich die Eingrenzung eines Primärtumors bestimmen. So kann beispielsweise bei der Detektion eines Tumors in der Lunge zwischen den Subtypen Adenokarzinom und Plattenepithelkarzinom unterschieden werden, indem entsprechende Antikörper – für ersteres – an CK7 oder TTF1 binden oder an CK5/6 oder p40, was für ein Plattenepithelkarzinom sprechen würde. 14
Studie zur verbesserten Krebstherapie mit Antikörpern
Es wird bereits seit einigen Jahren mit Antikörpern in der Krebstherapie geforscht.In den verfügbaren Immuntherapie-Behandlungsmöglichkeiten wird das körpereigene Immunsystem zur Zerstörung des Tumorgewebes rekrutiert, indem der zugegebene Antikörper, CD40, auf Oberflächen von Immunzellen bindet, diese aktiviert und die Produktion von körpereigenen T-Killerzellen anregt. In klinischen Studien sprangen weniger als 20 % der PatientInnen auf diese Behandlung an. Die Beobachtung hierbei war, dass die produzierten T-Killerzellen nicht in das Innere des Tumors gelangen konnten, da das Blutgefäßsystem von Tumoren undicht und unterentwickelt ist.
In der Studie aus dem Jahr 201915 wurden drei verschiedene Antikörper kombiniert, die zwei verschiedene Wirkungsmechanismen erfüllten, was zu einer effektiveren Zerstörung der Tumore führte. Es kam dabei zur Ergänzung der Behandlung mit CD40 durch zwei weitere Antikörper, welche anti-angiogenetische Wirkungen besitzen und für die Stabilisierung der Tumorblutgefäße verantwortlich waren. Der Einsatz dieser Antikörperkombination in verschiedenen Tiermodellen mit unterschiedlichen Krebsarten zeigte, dass dies im Vergleich zu den zuvor erhaltenen Ergebnissen zu einer deutlich stärkeren Zerstörung des Tumorgewebes führte. Im nächsten Schritt sollen klinische Studien beim Menschen erfolgen. 15
Einsatz von Antikörpern bei Laboranalysen
Im Labor können Antikörper durch immunologische Tests, beispielsweise mit einem ELISA, analysiert werden. Dieses Verfahren beruht auf einer enzymatischen Farbreaktion. Es kommt dabei zunächst zur Bindung und somit zu einer Anreicherung des nachzuweisenden Antigens über einen Erstantikörper an einer Mikrotiterplatte. Ein Enzym-gekoppelter Zweitantikörper führt zur Farbreaktion oder zur Chemolumineszenz (Abb. 6). Mit Hilfe eines Photometers kann schließlich die Signalstärke gemessen werden, welche Auskunft über die Konzentration des Antikörpers innerhalb einer Probe/eines Sorbents liefert. 16
Abb. 6 Mikrotiterplatte mit verschiedenen Antikörperkonzentrationen. Farbverlauf entsteht durch eine enzymatische Farbreaktion in Abhängigkeit von der Antikörperkonzentration.
Zu immunologischen Tests zählen auch Schnelltests, wobei die Antikörper auf einen Papierstreifen oder anderen Träger aufgebracht werden. Die Flüssigkeiten, welche für die Schnelltest verwendet werden können, sind beispielsweise Speichel, Urin oder Blut. Die Tests sind leicht in der Handhabung und liefern ein schnelles Ergebnis.
Nach dem Auftragen der Flüssigkeit, wandert diese entlang des Papierstreifens von der einen auf die andere Seite (Abb. 7). Enthält die Probe den gesuchten Stoff, repräsentiert durch das entsprechende Antigen, wird dieser an die Antikörper auf dem Teststreifen gebunden und es kommt zur einer Farbreaktion. Meist wird hierbei ein roter Strich sichtbar. Gelangt die Flüssigkeit an das Ende des Teststreifens, wird auch im Kontrollfenster ein roter Strich (in Abb. 7 grün) erkenntlich, was bedeutet, dass sich ausreichend Flüssigkeit auf dem Träger befand und der Test korrekt abgelaufen ist. Solche Verfahren sind vor allem durch Schwangerschaftstests oder durch COVID-19-Schnelltests bekannt. 17
Abb. 7 Träger mit Membran. Flüssigkeit wird auf das Testpolster aufgetragen und läuft entsprechend der Fließrichtung der Membran entlang. Auf der Testlinie befinden sich Antikörper, die zur Sichtbarmachung der Linie führen, wenn das Antigen aus der aufgetragenen Flüssigkeit daran bindet. Die Kontrolllinie wird sichtbar, wenn genügend Flüssigkeit diese erreicht hat.
Die Vorteile der Verwendung des fluidlabs R-300 bei Produktionsschritten von Antikörpern
Das fluidlab R-300 ist ein kleines Analysegerät, welches einen innovativen Zellzähler und ein leistungsfähiges Photospektrometer in einem vereint. Dabei ist es durch seine kleine Größe, mit der es auf eine Handfläche passt, und sein geringes Gewicht leicht zu transportieren. Diese Eigenschaften bringen zudem den Vorteil mit sich, dass Messungen mit dem fluidlab direkt unter der sterilen Werkbank durchgeführt werden können.
Die Viabilität wird ohne die Verwendung von Farbstoffen gemessen und das holographische Mikroskop muss nicht kalibriert werden. Dies spart Zeit und die Genauigkeit der Messung wird durch das Weglassen des zytotoxischen Farbstoffs, Trypanblau, gesteigert.
Bei der Antikörperproduktion kann das fluidlab R-300 gleich in mehreren Schritten der Proteinproduktion eingesetzt werden.
Bei der Präparierung der Vektoren, während des Bakterienwachstums, können mit dem Spektrometer des fluidlabs OD₆₀₀ Messungen durchgeführt werden, welche Auskunft über die Bakterienquantität liefert. Dies spielt eine wichtige Rolle bei der Antikörperproduktion, da die Bakterien Vektoren enthalten, um die Antikörper später in Zellen bilden zu können (s.o. Verfahren zur Generierung monoklonaler Antikörper).
Abb. 8 Das fluidlab R-300 kann bei diversen Schritten der Antikörperproduktion eingesetzt werden. Bei der Präparierung der Vektoren und Vermehrung dieser in Bakterien, kann mit dem fluidlab die OD600 gemessen werden. Nach Einbringen der Vektoren in Zellen, kann der Zellzähler des R-300 genutzt werden, um die Zellen zu zählen und ihre Viabilität färbungsfrei zu bestimmen. Bei der Proteinbestimmung misst das Photospektrometer des fluidlabs die Extinktion und die Konzentration der Proteine kann mithilfe einer erstellten Kalibrierungskurve direkt und einfach bestimmt werden.
Die Zellen, in denen die Antikörper gebildet werden, können somit mit dem fluidlab automatisch gezählt und ihre Viabilität färbungsfrei bestimmt werden. Das große Field of View von 5,3 mm² und die vollautomatische Messung generieren exakte, reproduzierbare Ergebnisse und eine hohe statistische Sicherheit. Typische Zellen, die bei der Proteinbestimmung eingesetzt werden, sind bereits für die Messung mit dem fluidlab R-300 validiert worden:
- HEK
- CHO
- HeLa
- Sf9
Im letzten Schritt der Antikörperherstellung müssen die Antikörper extrahiert, purifiziert und quantifiziert werden. Letzteres erfolgt meistens über die Proteinbestimmung nach Bradford bei 595 nm und kann somit ebenfalls mit dem fluidlab durchgeführt werden. Hierbei bietet das Photospektrometer des fluidlabs die Möglichkeit der Erstellung und Speicherung von Kalibrierungskurven für die schnelle Messung der kolorimetrischen Assays.
Zusätzlich bietet die kostenlose Datenexport-Software von anvajo eine simultane Übertragung der Ergebnisse auf beliebig viele Endgeräte, was den Datentransfer und die Datenanalyse noch einfacher macht.
Wissenschaftliche Quellen
1 Nelson, P. N., Reynolds, G. M., Waldron, E. E., Ward, E., Giannopoulos, K., & Murray, P. G. (2000). Monoclonal antibodies. Molecular pathology: MP, 53(3), 111–117.
2 Oswin G. (1971). Grundlagen der Immunologie:II. Antikörperstruktur und -funktion; Spätreaktion, Deutsches Ärzteblatt, 68(26): A-1983.
3 Edelmann G.M. (1970). The structure and function of antibodies. Scientific American, (223): 34-42.
4 Bröker B. et al. (2019). Immunisierung. In: Grundwissen Immunologie, 4 (13): 247-254.
5 Mössner, J., Neubauer, A. (2019). Monoklonale Antikörper. Internist, 60: 1009–1013.
6 Köhler, G., Milstein, C. (1975). Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature, 256: 495–497.
7 Yamada T. (2011). Therapeutic monoclonal antibodies. The Keio journal of medicine, 60(2): 37–46.
8 Janeway CA et al. (2001). Immunobiology. The Immune System in Health and Disease, (5): 9-12 ff.
9 Birch, J. R., & Racher, A. J. (2006). Antibody production. Advanced drug delivery reviews, 58(5-6), 671–685.
10 Smith G. P. (2019). Phage Display: Simple Evolution in a Petri Dish (Nobel Lecture). Angewandte Chemie, 58 (41): 14428-14437.
11 Jonas, G. et al. (2001). Binding of phage-displayed HIV-1 Tat to TAR RNA in the presence of cyclin T1. Journal of biomedical science, 8(5): 430–436.
12 Rink L. et al., (2012). Das angeborene Immunsystem. In: Immunologie für Einsteiger. Spektrum Akademischer Verlag, 1(30): 39.
13 Klebe, G. (2019). Entwurf und Wirkung von Arzneistoffen. Wirkstoffdesign. Spektrum Akademischer Verlag, (2): 634.
14 Förster, S., & Tannapfel, A. (2019). Einsatz monoklonaler Antikörper in der pathologischen Diagnostik. Use of monoclonal antibodies in pathological diagnostics. Der Internist, 60(10): 1021–1031.
15 Abhishek S. A. et al. (2019). Optimized antiangiogenic reprogramming of the tumor microenvironment potentiates CD40 immunotherapy. Proceedings oft he National Academy of Sciences of the United States of America, 117 (1): 541-551.
16 Lequin R. M. (2005). Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Clinical chemistry, 51(12): 2415–2418.
17 Neumeister B et al. (2018). Arbeitsmethoden, Referenzbereiche, Differentialdiagnose, Diagnosestrategien. Klinikleitfaden Labordiagnostik, Stuttgart: Urban und Fischer, (6): 265.
