Kalibrierungskurven dienen der Konzentrationsbestimmung einer Probe mit unbekannter Konzentration. Hierbei werden sogenannte Standardlösungen mit ähnlichen Eigenschaften wie die zu messende Probe erstellt und deren Extinktion gemessen.
Die Konzentration der Standardlösungen ist bekannt, sodass die gemessene Extinktion gegen die Konzentration aufgetragen werden kann. Wird im Anschluss die Extinktion der Probe mit unbekannter Extinktion gemessen, kann mit einer einfachen Formel die Konzentration berechnet werden.1
Erfahren Sie in diesem Text mehr über:
- Die Ermittlung der Konzentration einer Substanz mithilfe einer Kalibrierungskurve
- Die Kalibrierung eines Spektralphotometers
- Das Ziel einer Kalibrierung und in welchen Laborsituationen sie angewandt wird
- Die Vorteile des fluidlabs R-300 bei der Erstellung von Kalibrierungskurven
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Mithilfe einer Kalibrierungskurve kann die Konzentration einer Substanz ermittelt werden
Kalibrierungskurven oder auch Kalibrierkurven werden in der analytischen Chemie als allgemeine Methode genutzt, um die unbekannte Konzentration einer Substanz in einer Probe (Analyt) zu bestimmen. Die Bestimmung erfolgt dabei durch einen Vergleich der Probe mit einer Serie von Standardproben, deren Konzentrationen bekannt sind.
Die Konzentration der zu messenden Substanz führt zu einer Änderung des analytischen Signals bzw. der instrumentellen Reaktion, was durch eine Kalibrierungskurve angezeigt werden kann.
In den meisten Fällen ergibt sich eine lineare Beziehung beim Auftrag der Instrumentenreaktion gegen die Konzentration des Standards.1
Welche Voraussetzungen müssen die Standardproben erfüllen?
Es ist wichtig eine geeignete Standardprobe für die Kalibrierung zu wählen, um die Konzentration des Analyten berechnen zu können.
Daher sollte die gewählte Referenz folgenden Voraussetzungen erfüllen:2
- gleiche Matrix wie Analyt
- sehr kleine systematische Fehler (z.B. Verflüchtigung, Volumenfehler, etc.)
- hohe Reproduzierbarkeit
Wie funktioniert die Kalibrierung eines Spektralphotometers?
Allgemein handelt es sich bei einer Kalibrierung um die Überprüfung von Messgeräten, deren Vorgaben nicht gesetzlich geregelt sind. Die Kalibrierung von Messgeräten ist wichtig, da sie zum Beispiel für die Qualitätssicherung oder die Einhaltung von Verfahrensvorschriften, wie DIN EN ISO 9001:2000 garantiert.3
Mithilfe einer Kalibrierung kann der Zusammenhang zwischen den gemessenen Werten oder der Erwartung der Ausgangsgröße und dem wahren Wert der Eingangsgröße vorliegenden Messgröße für die betrachtete Messeinrichtung bei vorgegebenen Bedingungen ermittelt werden.4
Die UV/Vis Messung mit Spektralphotometern kommt besonders häufig in der klinischen Chemie, der Pharmaindustrie, Forschung oder auch in der Qualitätssicherung zum Einsatz. Dabei gibt es Vorschriften, die eine regelmäßige Leistungsüberprüfung der eingesetzten Spektralphotometer fordern.5
Die Kalibrierung des Spektralphotometers wird mit speziell dafür vorgesehenen optischen Filtern durchgeführt. Diese besitzen gewisse Absorptionscharakteristika und weisen ein Absorptionsmaximum bei bestimmten Wellenlängen auf. Es wird nacheinander die Extinktion der einzelnen Filter gemessen. Diese reicht von gering bis hoch und wird deshalb in einem breiten Extinktionsbereich von ca. 0,3-2 bestimmt. Anschließend werden die erhaltenen Extinktionswerte mit den Soll-Werten der Filter verglichen. Dabei sollte die Abweichung nicht mehr als 1 % betragen.5
Kalibrierungskurve zur Berechnung des Konzentrationsgehalts
Ist das Photometer richtig kalibriert, können daran Messungen durchgeführt werden. Vor der Messung einer Probe mit unbekannter Konzentration (Analyt), wird zuvor eine Kalibrierungskurve erstellt. Dies erfolgt, indem Standardlösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen erstellt werden. Wird die Konzentration von einem Protein gemessen, wird oft zu BSA (Bovine Serum Albumin) als Standardprobe gegriffen.
Es ist wichtig, dass die Ausgangskonzentration der Referenz bekannt ist. Anschließend wird diese verdünnt, sodass 3-10 (Abb.1 (Ref 1- 5)) Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen hergestellt werden. Diese werden am Photometer gemessen und die Extinktion jeder Probe notiert.
Als nächstes erfolgt die Auftragung der gemessenen Extinktion gegen die Konzentration der Verdünnung (Abb. 1). Es ergibt sich daraus die Kalibrierungskurve und eine entsprechende Gleichung.5
Nachdem die Kalibrierungskurve mittels einer Verdünnungsreihe der Standardlösung erstellt wurde, kann nun die Konzentration eines Analyts (Abb.1 (sample with unknown concentration)) in einer Probe bestimmt werden. Dabei sollte sich die gemessene Konzentration im Bereich der Verdünnungen, also zwischen der niedrigsten und höchsten Konzentration der Standardlösung (Abb.1) befinden. Ist dies nicht der Fall, gilt es den Standard weiter zu verdünnen bzw. aufzukonzentrieren und die Messungen erneut durchzuführen. Dies wird durchgeführt, bis sich der Extinktionswert des Analyten auf der Kalibrierungskurve befindet.
Abb. 1 Eine Standardlösung wurde verdünnt (Ref 1- Ref 5) und ihre Extinktion wurde gemessen, um eine Kalibrierkurve zu erstellen (rechts). Mithilfe der Kalibrierungskurve kann dann die Konzentration der unbekannten Probe ermittelt werden.
Aus der erhaltenen Kalibrierungskurve ergibt sich eine zugehörige Gleichung. Im Anschluss kann der Extinktionswert des zu untersuchenden Analyten in diese Formel er Kalibrierungskurve eingetragen und nach der Konzentration umgestellt sowie berechnet werden.
Verlaufen alle Kalibrierungskurven linear?
Nicht immer verlaufen Kalibrierungskurven linear. Dies geschieht, wenn die erhaltenen Signale nicht über den gesamten Messbereich mit der Konzentration linear einhergehen. In diesen Fällen kann es passieren, dass das Absolutglied (b0) der Kalibrierfunktion besonders groß ausfällt. Wenn ein kleiner Bereich nicht linear ist, kann eine lineare Anpassung durchgeführt werden, ohne zu großen Fehlern zu führen (Abb. 3). Bei Überschreitung des Bereichs, können jedoch Fehler entstehen. Daher sollten bei nichtlinearen Kalibrierungskurven Anpassungen der nichtlinearen Funktionen durchgeführt werden.5
Abb. 3 In einem kleinen linearen Bereich, kann dieser zur Konzentrationsbestimmung herangezogen werden. Der lineare Bereich sollte nicht verlassen werden. A: 1. Messung, B: 2. Messung, b0: Absolutglieder ober- und unterhalb von 0.
Ziel einer Kalibrierung mit Standardproben
Das Hauptziel einer Kalibrierung ist es die Konzentration einer Substanz in einer unbekannten Probe zu bestimmen. Es gibt jedoch auch weitere Gründe, weshalb eine Kalibrierung wichtig ist:2
- Sicherung guter analytischer Ergebnisse
- Qualitätssicherung
- Verfahrensvorschriften (Bsp. DIN EN ISO 9001:2000)
In welchen Laborsituationen wird das Kalibrierungsverfahren genutzt?
Im Labor wird die Kalibrierungskurve häufig zur Analyse von Flüssigkeiten eingesetzt. Die Einsatzbereiche begrenzen sich dabei nicht nur auf die Chemie, wie analytische Chemie, Biochemie oder pharmazeutische Chemie, sondern kommen beispielsweise auch in der Umweltanalytik vor. Dort kann die Kalibrierungskurve genutzt werden, um beispielsweise die Konzentration eines bestimmten Umweltschadstoffes zu ermitteln.
Ermittlung der Konzentration eines Umweltschadstoffes
Die Kalibrierung wird unter anderem im Immissionsschutz eingesetzt, um die Einhaltung von Grenzwerten verschiedener Umweltschadstoffe zu gewähren. Es kann sich bei den Schadstoffen zum Beispiel unter anderem um Schwefeldioxid, Stickstoffdioxid, Kohlenmonoxid oder Schwebstaub handeln.
Die Konzentration von schwarzem Rauch, einem Schwebstoff, wird auf einem Filter mit einem Reflexionsphotometer gemessen. Zuvor erfolgt die Erstellung einer Kalibrierungskurve mittels entsprechender Standards, die es erlaubt die Extinktionswerte in gravimetrische Werte (µg/m³) umzurechnen, woraus sich die Konzentration des Schwebstoffes berechnen lässt.6
Bestimmung des Koffeingehalts in Lebensmitteln
Auch in der Lebensmitteltechnologie werden Kalibrierungen zur Bestimmung verschiedener Substanzen genutzt. Einige Lebensmittel, wie Tee, Kaffee oder einige Softgetränke enthalten Koffein, ein natürliches Molekül, das in unterschiedlichsten Pflanzen vorkommt. Durch die Stimulation vom Herzkreislauf- und dem zentralen Nervensystem, hat der Konsum von Koffein eine anregende Wirkung auf den Menschen.
Allerdings kann ein übermäßiger Konsum von koffeinhaltigen Produkten oder eine hohe Empfindlichkeit gegenüber dem Mittel zu Nervosität sowie Herzrhythmusstörungen führen. Für gesunde Erwachsene gilt die Einnahme von bis zu 400 mg Koffein über den Tag verteilt als unbedenklich. Eine höhere Dosis kann bereits zu körperlichen Beschwerden führen. 7
Aus diesem Grund ist es wichtig, den Gehalt von Koffein in Lebensmitteln zu bestimmen, was mittels UV-Spektroskopie möglich ist. Hierfür wird zunächst eine Kalibrierungskurve mit koffeinhaltigen Standards erstellt. Als Standard dienen Proben, in denen unterschiedliche Mengen Koffein in Wasser gelöst sind und nacheinander am Photometer gemessen werden.
Im Anschluss kann die Probe am Photometer gemessen werden, deren Koffeinkonzentration sich aus der Kalibrierungskurve bzw. aus ihrer Gleichung bestimmen lässt (s.o).8
Erstellung von Kalibrierungskurven mit dem fluidlab R-300
Kalibrierungskurven können vom R-300 automatisch erstellt werden, sodass es nicht notwendig ist ein weiteres Programm, wie zum Beispiel Excel heranzuziehen, um die Kurve zu berechnen.
Die Kurve kann anschließend für die Quantifizierung einzelner Proben gespeichert werden. Dies hat zum Vorteil, dass Assays, die häufig oder on-the-go durchgeführt werden, auf die zuvor eingespeicherte Kurve zurückgreifen können.
Die Erstellung einer Kalibrierungskurve mit dem fluidlab erfolgt, indem entweder eine Verdünnungs- oder eine Konzentrationsreihe des Standards gemessen wird. Hierfür wird vorher eingestellt, wie viele Proben gemessen werden und welche Konzentrationen bzw. Verdünnungen verwendet wurden.
Nach der Messung erstellt das Gerät die Kalibrierungskurve automatisch. Im Anschluss kann mit der Extinktionsmessung des Analyten, dessen Konzentration es zu bestimmen gilt, fortgesetzt werden. Wurde die Messung durchgeführt, erscheint die gemessene Extinktion sowie die zugehörige Konzentration, welche auf Grundlage der Kalibrierungskurve durch das R-300 automatisch ermittelt wurde.
Zusätzlich erhält man ein Diagramm der Kalibrierungskurve, in welchem der Extinktionswert des Analyten aufgetragen ist.
Weitere Vorteile des fluidlab R-300
Die automatische Erstellung einer Kalibrierungskurve mit dem fluidlab hat viele Vorteile. So bedarf es keines zusätzlichen Programms, um die Kurven zu erstellen. Dies ist bereits ein zeitsparender Faktor. Außerdem können so mehrere Proben zügig hintereinander gemessen werde, deren Konzentrationen direkt ermittelt werden. Darüber hinaus gibt es folgende Vorteile:
Ortsunabhängige Messungen
Die kompakte Größe und das geringe Gewicht des fluidlabs, machen es zu einem handlichen und tragbaren Gerät. Dadurch wird die Möglichkeit geboten, Messungen ohne hohen Aufwand, an verschiedenen Arbeitsorten durchzuführen.
2 in 1: Cell Counter und Spektrometer
Das fluidlab kombiniert zwei häufig im Labor verwendete Geräte in einem. So lässt es sich einerseits als Cell Counter, aber auch und als leistungsfähiges Spektrometer einsetzen. Während die Funktion als Spektrometer unter anderem den Vorteil einer automatischen Kalibrierung liefert, bringt auch die Funktion als Cell Counter viele Vorteile gegenüber anderen Geräten:
- Großes Field-of-View (5.3 mm2) für eine hohe statistische Sicherheit
- Autofokus der Zellen
- Färbungsfreie Viabilitätsmessung
Mehr Arbeitsfläche
Labormessgeräte haben nicht selten die Eigenschaft groß und unhandlich zu sein, wodurch sie meistens einen festen Standort im Labor haben und dort viel Platz einnehmen.
Das fluidlab R-300 ist so klein, dass es die Größe einer Handfläche einnimmt. Dies verschafft mehr Fläche, die zum Arbeiten oder für weitere Laborgeräte genutzt werden kann. Außerdem kann es direkt unter der Clean Bench verwendet werden.
Wissenschaftliche Quellen
1Harris, Daniel Charles (2014). Qualitätssicherung und Kalibrationsmethoden, In: Lehrbuch der Quantitativen Analyse. Springer Spektrum, Berlin, Heidelberg, 8, 155-133.
2Schwedt, G., Schmidt, T. C., & Schmitz, O. J. (2016). Probenvorbereitung, In: Analytische Chemie: Grundlagen, Methoden und Praxis. John Wiley & Sons, Wiley-VCH, Weinheim, 3, 63 ff.
3DIN 1319-1:1995 Grundlagen der Meßtechnik, 1, 22
4Brunner, F. K., & Woschitz, H. (2001). Kalibrierung von Messsystemen: Grundlagen und Beispiele. Qualitätsmanagement in der Geodätischen Messtechnik. Konrad Wittwer Verlag, DVW Schriftenreihe, 42, 70-90.
5Brereton I. M. (1997). Spectrometer calibration and experimental setup. Basic principles and procedures. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 60, 363–410.
6Eickelpasch D., Eickelpasch G. (2004). Umweltforschungsplan des Bundesministeriums für Umwelt, Naturschutz und Reaktorsicherheit. Feststellung und Bewertung von Immissionen-Leitfaden zur Immissionsüberwachung in Deutschland, Umweltbundesamt, 3, 27 ff.
7Bundesinstitut für Risikobewertung (2015). Fragen und Antworten zu Koffein und koffeinhaltigen Lebensmitteln, einschließlich Energydrinks, https://www.bfr.bund.de/cm/343/fragen-und-antworten-zu-koffein-und-koffeinhaltigen-lebensmitteln-einschlie%C3%9Flich-energy-drinks.pdf [30.03.2022].
8Krüger B., Tausch M.W. (2012), Coffein-Bestimmung - Ein Messexperiment zur Dopinganalyse. Praxis der Naturwissenschaften - Chemie in der Schule, 61(6), 5.
