Bei der Extinktion handelt es sich um ein Maß für die stoffabhängige Abschwächung der Intensität einer Lichtstrahlung durch Absorption oder Streuung, nachdem der Strahl eine Materie durchquert (Abb. 1).¹

In Laboren werden Extinktionsmessungen mit Hilfe eines Spektrometers durchgeführt und dienen der Bestimmung verschiedener Stoffe bzw. deren Konzentrationen.

In der Biochemie wird die Extinktionsmessung zum Beispiel zur Konzentrationsbestimmung von Coenzymen, DNA- oder Proteinlösungen, sowie zur Bestimmung der Zelldichte von beispielsweise Bakterienkulturen verwendet.¹

Abb. 1 Schematische Darstellung des Durchquerens eines Lichtstrahls durch eine getrübte Materie in einer Küvette. Es kommt zur stoffabhängigen Abschwächung der Intensität des Strahls, welche am Sensor gemessen wird. Abbildung angepasst aus: Chemieunterricht.de, das Lambert-Beersche-Gesetz, https://www.chemieunterricht.de/dc2/rk/rk-lbg.htm [30.05.2022]

Testen Sie das fluidlab R-300 kostenfrei und unverbindlich!

Sie möchten Ihren Laboralltag noch effizienter gestalten oder Analysen ortsunabhängig ausführen und sind an innovativer Technologie interessiert, die sich genau das zum Ziel gesetzt hat? Dann testen Sie jetzt unser patentiertes fluidlab R-300 – ganz unverbindlich!

Jetzt Testgerät anfordern

Die Messung der Lichtstärke und -schwächung in der Photometrie

Bei der Photometrie wird ein Lichtstrahl mithilfe eines Photometers durch eine Lösung, Suspension oder Emulsion geschickt und die Extinktion gemessen. Die Extinktion gibt an, wieviel Licht von der Probe gestreut oder absorbiert wurde. Anhand der gemessenen Extinktionswerte kann dann die Konzentration gelöster Substanzen in einer Flüssigkeit bestimmt werden.

An der Abschwächung der Lichtstrahlung beim Durchqueren einer Probe sind im Allgemeinen die physikalischen Prozesse Absorption und Streuung beteiligt.

Sind die Teilchen in einer Lösung oder Suspension groß im Verhältnis zur Wellenlänge des Lichts, können die Lichtwellen sie nicht mehr ungehindert umgehen. Dadurch kommt es zu einer starken Ablenkung bzw. Streuung des Lichts. Solch eine Streuung wird zum Beispiel bei der photometrischen Messung von Blut beobachtet. Die Erythrozyten im Blut sind zu groß, als dass das Licht ungehindert um sie herumgeleitet werden könnte.²

Weiterhin kann es zur Absorption des Lichts durch die Teilchen in der Flüssigkeit kommen. Das geschieht durch die Wechselwirkungen zwischen den elektromagnetischen Wellen des Lichts und der Elektronenhülle der gelösten Moleküle innerhalb der Lösung. Licht wird dabei meist in Wärme umgewandelt. In Abhängigkeit der chemischen Struktur der Moleküle in der Probe können verschiedene Wellenlängenbereiche des Lichts unterschiedlich stark absorbiert werden. Wird beispielsweise eine rot erscheinende Flüssigkeit mit weißem Licht bestrahlt, so werden die gelben, grünen und blauen Lichtbestandteile absorbiert, das rote Licht strahlt dagegen hindurch. Dies lässt sich dadurch erklären, dass während beispielsweise grünes Licht aus grüner Farbe, blaues Licht aus blauer, usw. besteht, das weiße Licht sich aus allen Farben zusammensetzt. Somit wird die rote Flüssigkeit mit allen Farben (optisch als weiß zu erkennen) bestrahlt, wodurch einige von ihnen absorbiert werden, und das rote Licht durchtritt.

Photometrische Messungen werden meist im Wellenlängenbereich des ultravioletten (UV), sichtbaren (VIS) oder infraroten (IR) Lichts durchgeführt. Eine Extinktionsmessung über verschiedene Wellenlängen wird als Spektroskopie bzw. Photometrie bezeichnet, z. B. die UV/VIS-Spektroskopie oder die Infrarotspektroskopie.²

Bestimmung der Konzentration durch Extinktionsmessungen

Die Extinktion misst also die Schwächung der Intensität des Lichts bei einer bestimmten Wellenlänge. Definiert wird sie durch die Gleichung³:

E = lg(I₀/I)

E - gemessene Extinktion
I₀ - Intensität des in die Lösung einfallenden Lichts
I – Intensität des austretenden Lichts

Bei einer Extinktionsmessung zur Bestimmung der Konzentration eines gelösten Stoffes ist Voraussetzung, dass sich der lichtabsorbierende Stoff in einer optisch durchlässigen Flüssigkeit, wie zum Beispiel Wasser, befindet. In diesem Fall kann die Konzentration über das sogenannte Lambert-Beer'sche Gesetz³, ermittelt werden:

E = ε*c*d

E - gemessene Extinktion
ε - für jeden Stoff charakteristische molare Extinktionskoeffizient
c - Konzentration der Lösung
d - Schichtdicke

Der Bestimmung der Konzentration durch die Messung der Extinktion liegt also das genannte Lambert-Beer’sche Gesetz zugrunde, welches besagt, dass ein linearer Zusammenhang zwischen Extinktion und Konzentration besteht. Allerdings gibt es auch Abweichungen vom Lambert-Beer‘schen Gesetz, insbesondere bei hohen Stoffkonzentrationen. Daher wird in der Regel vor der eigentlichen Messung eine Kalibrierkurve erstellt, um die Linearität zu überprüfen. Hierbei wird die Extinktion verschiedener Standardlösungen gegen ihre Konzentration aufgetragen³. Lesen Sie unseren Text zu Kalibrierungskurven, um mehr darüber zu erfahren.

Messverfahren zur Bestimmung des Extinktionswertes

Photometrische Messungen messen die Transmission von monochromatischem Licht. Die Transmission beschreibt die Durchlässigkeit eines Mediums für elektromagnetische Strahlung, z.B. sichtbares Licht.⁴

Das Messprinzip photometrischer Analysen

Photometrische Messungen erfolgt an Photometern. Hauptelemente der Geräte sind eine Lichtquelle, ein Filter oder Monochromator zur Lichtzerlegung, ein Detektor sowie ein Anzeigesystem. In den Strahlengang des Photometers wird die Küvette mit der zu bestimmenden Lösung platziert.

Von der Lichtquelle des Photometers geht ein Strahl einer bestimmten Wellenlänge aus, der durch den Filter selektiert wird. Der Lichtstrahl gelangt zur Küvette, wo er reflektiert, absorbiert bzw. gestreut wird. An der Photozelle, an die eine Intensitätsanzeige geschlossen ist, kommt das restliche Licht an, wo es gemessen wird. Angezeigt wird schließlich die Extinktion.⁵

Worin besteht der Unterschied zwischen Einstrahl-Photometern und Zweistrahlgeräten?

Unterschieden wird zwischen Ein - und Zweistrahlphotometern. Bei Einstrahlphotometern gibt es einen Strahlengang, innerhalb welchem sowohl die Blankküvette als auch die Messküvette einzeln nacheinander in den Strahlengang für den Leerabgleich gebracht werden (Abb.2).

Bei dem Blank handelt es sich um eine Küvette, welche lediglich das Medium enthält, in dem die zu messende Substanz gelöst ist. Die Messung des Leerwerts mit einem Blank wird durchgeführt, um die Absorption des Mediums zu messen und diese mit der gemessenen Extinktion der Substanz zu verrechnen.⁵

Beim Zweistrahlphotometer (Abb.3) hingegen können die Blankküvette und die Messküvette gleichzeitig durchstrahlt werden, da sich hier der Lichtstrahl in zwei Strahlen teilt. Das ermöglicht die automatische Kompensierung der Leerwertabsorption. Dies macht die manuelle Abgleichung des Leerwerts, bei der Aufnahme von Spektren bei unterschiedlichen Wellenlängen, überflüssig.⁶

Abb. 2 Aufbau eines Einstrahlphotometers. Die Leer- und Messküvetten werden einzeln nacheinander gemessen. Abbildung angepasst aus: Lexikon der Biologie – Spektrum akademischer Verlag, Photometer, https://www.spektrum.de/lexikon/biologie/photometer/51334 [30.05.2022]

Abb. 3 Aufbau eines Zweistrahlphotometers. Die Leer- und Messküvette können gleichzeitig gemessen werden. Abbildung angepasst aus: Lexikon der Biologie – Spektrum akademischer Verlag, Photometer, https://www.spektrum.de/lexikon/biologie/photometer/51334 [30.05.2022]

Welche Erkenntnisse liefern die Extinktionsmessungen?

Die Extinktionsmessung ist für mehrere Bereiche relevant. Zum Beispiel kann die Bestimmung der Absorption zur qualitativen Identifizierung der gemessenen Probe angewandt werden. Über Kalibrierungskurven kann zudem die Konzentration einer absorbierenden Probe bestimmt werden.⁷

Außerdem spielen Extinktionsmessungen bei kinetischen Reaktionen eine zentrale Rolle, da sich hier die Konzentration der absorbierenden Probe über die Zeit ändert. Zur Abnahme der Konzentration des Reaktionsteilnehmers kommt es, da die Probe durch die Zugabe von Enzymen katalysiert wird und ein neues Produkt entsteht. Während die Reaktion abläuft, kann die Reaktionsgeschwindigkeit durch die zeitliche Änderung der Extinktion gemessen werden.⁸

Diese Möglichkeiten machen die Extinktionsmessung für diverse Branchen anwendbar.

Impulse für die Biochemie

Auch in der Biochemie sind Extinktionsmessungen ein wichtiges Hilfsmittel zur quantitativen Bestimmung zahlreicher Biomoleküle.

Die Reinheit und die Konzentration (DNA und RNA) können beispielsweise photometrisch bestimmt werden. Die Messung erfolgt im UV-Bereich bei 260 bzw. 280 nm.⁷

In einem Absorptionsspektrum von 230 bis 320 nm weist extrahierte DNA ein Absorptionsmaximum bei 260 nm (A260) auf. Andere organische Substanzen wie Proteine oder Kohlenhydrate haben ihr Absorptionsmaximum ebenfalls im UV-Bereich, nämlich bei 280 nm (A280). Um die Qualität bzw. Reinheit der Nukleinsäuren bewerten zu können, wird daher häufig eine zusätzliche Absorptionsmessung bei 280nm durchgeführt. Der Quotient aus A260/A280 ist ein Maß für die Reinheit der Probe. Liegt der Wert in einem Bereich von 1,8-2,0, gilt die DNA bzw. RNA als rein und sauber extrahiert. Liegt der ermittelte Wert darunter, wird so häufig eine deutliche Verunreinigung der Probe durch Proteine angezeigt.⁷

Die Berechnung der Konzentration c [μg/mL] der jeweiligen Nukleinsäure erfolgt durch die aus einer Umstellung des Lambert-Beer’schen Gesetzes resultierenden Formel:

c = A260*VF*UF

c - Konzentration der Nukleinsäure
A260 - Absorption bei 260 nm
VF - Verdünnungsfaktor
UF - Umrechnungsfaktor

Der Umrechnungsfaktor ergibt sich aus dem Umkehrwert des Extinktionskoeffizienten und ist spezifisch für jede Probe: für doppelsträngige DNA liegt er bei 50 und für RNA bei 40.

In der Biochemie kann auch die quantitative Ausbeute an Protein photometrisch bestimmt werden. Hierfür gibt es eine Vielzahl an Möglichkeiten. Zum einen kann das Absorptionsspektrum einer Proteinlösung direkt bei 280 nm gemessen werden. Die Konzentration ist dabei direkt linear zur Absorption. Zum anderen kann die Bestimmung jedoch indirekt, über kolorimetrische Assays erfolgen.

Der zu untersuchenden Proteinlösung wird ein Farbstoff hinzugegeben, welcher einen Komplex mit den enthaltenen Proteinen bildet, und so zu einer Verfärbung der Lösung führt. Ein Beispiel hierfür ist der Bradford-Assay, bei welchem Coomassie-Brillant-Blau G-250 als Farbstoff eingesetzt wird. Dieser besitzt ein Absorptionsmaximum bei 470 nm. Bei der Komplexbildung mit dem Protein verschiebt sich das Maximum jedoch zu 595 nm.⁷

Möglichkeiten in der Umweltanalytik

Die Photometrie kommt auch in der Umweltanalytik zum Einsatz, da es sich hierbei um eine besonders sensible und selektive Analysemethode handelt, die sich als sehr exakt und zuverlässig erwiesen hat.⁹

So wird die Photometrie häufig zur Untersuchung der Wasserqualität herangezogen. Es ist sehr wichtig, dass sich im Grundwasser keine Schadstoffe befinden oder der Gehalt einiger Bestandteile, wie zum Beispiel der Nitratgehalt, einen bestimmten Wert nicht übersteigt. Die Untersuchung des Wassers dient dabei nicht nur dessen Einsatz in der Natur und Umwelt, sondern ist auch in der Industrie, der kommunalen Wasserversorgung oder Fischzucht von großer Bedeutung. ¹⁰

Bei der Untersuchung kommt es zum Einsatz von kolorimetrischen Verfahren, bei denen die Bestandteile von Wasser mit speziellen Chemikalien eingefärbt werden. Es kommt dabei zu einer Färbung durch die Entstehung chemischer Verbindungen zwischen den zu messenden Ionen, welche durch die Schadstoffe enthalten sind, und der Chemikalien. Die Intensität der Farbe hängt von der Konzentration der Ionen ab und macht die photometrische Messung möglich.¹⁰

Voraussetzungen bei Extinktionsmessungen

Die Messung der Extinktion sollte unter Einhaltung folgender Kriterien erfolgen.

hohe Genauigkeit
Sensibilität
Reproduzierbarkeit
Linearität
einfache Handhabung

Des Weiteren sollten Photometer bzw. Spektrometer die Möglichkeit bieten auf Basis abgespeicherter Kalibrierkurven aus der gemessenen Extinktion automatisiert die Probenkonzentration zu berechnen.

Wie funktioniert die Extinktionsmessung mit dem fluidlab R-300?

Für die Extinktionsmessung mit dem R-300 eignen sich Standardküvetten (10 mm) mit einem Füllvolumen von 4,5 ml bzw. 3 ml, die für die Messung mit einem Probenvolumen von 2,5 ml bzw. 1,5 ml aufgefüllt werden. Die zu messende Flüssigkeit sollte hierfür gut durchmischt sein.

Die Küvette wird nun in den speziellen Adapter des Geräts gestellt. Der Adapter erlaubt es dem Licht die Frontseite in einem kleinen Abstrahlwinkel zu passieren. Innerhalb der Küvette kommt es zur Reflektion durch Partikel in der Flüssigkeit.

Der Strahl passiert schließlich die Rückseite des Adapters und wird detektiert, woraufhin die Extinktion am Display des R-300 abgelesen werden kann.

Wie eine Messung mit dem R-300 durchgeführt und die Küvette verwendet wird, ist in diesem Einführungsvideo zum anvajo fluidlab R-300 genauer dargestellt.

Welche Vorteile bietet die Extinktionsmessung mit dem fluidlab R-300 gegenüber herkömmlichen Photometern?

Das fluidlab R-300 hat gegenüber anderen Photometern den Vorteil, dass es sich um ein sehr kleines und handliches Gerät handelt, welches intuitiv bedient werden kann. Es wird ein Wellenlängenbereich von 375 nm-700 nm mit einem photometrischen Messbereich von 0-2,5 abgedeckt, woraus sich eine sehr hohe Linearität ergibt.

Hohe Linearität

Das fluidlab R-300 besitzt eine photometrische Genauigkeit von 0,01. Die hohe Linearität des Geräts ergibt sich aus der kleinen spektralen Bandbreit von 2 nm.

Im direkten Vergleich mit einem der am häufigsten genutzten Spektrometern, wies das R-300 über einen größeren Wertebereich eine Linearität auf (Abb.4). Diese Eigenschaft ermöglicht eine sehr genaue Auswertung von Assays in hohen Konzentrationsbereichen (siehe Performance Report zum Spektrometer).

Abb. 4 Vergleich der Linearität einer Trypanblau-Verdünnungsreihe zwischen dem fluidlab R-300 und einem weit verbreiteten Wettbewerber. Die Linearität des R-300 ist über den betrachteten Wertebereich höher als beim Wettbewerber.

Erfüllung der photometrischen Genauigkeitsstandards nach den Anforderungen der Pharmakopöe

Es ist wichtig, dass Photometer bestimmte Richtlinien erfüllen, welche das Messsystem die spektralen und die photometrischen Messgenauigkeit betreffen. Auf diese Weise soll eine einheitliche Messung mit Photometern generiert werden.

Die Eichung der Geräte erfolgt in der Regel mittels klar definierter Referenzmaterialien. Hierfür werden häufig mit bestimmten Flüssigkeiten gefüllte Glasküvetten oder Küvetten mit speziellen Glasfiltern verwendet.

Das fluidlab R-300 wird während der Produktion mit zertifizierten Referenzfiltern der Firma Hellma Analytics kalibriert. Tests hinsichtlich der Genauigkeit, sowie der Reproduzierbarkeit und Linearität konnten zeigen, dass das anvajo fluidlab R-300 die Anforderungen der Pharmakopöe erfüllt (siehe Performance Report zum Spektrometer).

Mehr Details hierzu können Sie in unserem Leistungsreport des R-300 nachlesen.

Vielfältige Möglichkeiten zur Untersuchung und Analyse von Assays

Alles in Allem ermöglicht das fluidlab eine Vielzahl an kolorimetrischen und turbidimetrischen Analysen im Bereich von 375 nm-700 nm. Bei kolorimetrischen Analysen ist es wichtig, dass die zumessende Substanz eine deutliche Färbung aufweist oder in eine gefärbte Substanz umgesetzt wird und in einer definierten Beziehung zur ursprünglichen Substanz steht.¹¹ Turbidimetrischen Analysen, wie z.B. Messungen der optischen Dichte bei 600 nm (OD 600), bei welcher das Wachstum von Bakterien bestimmt wird, sind ebenfalls mit dem fluidlab R-300 durchführbar.

Die hohe Linearität über einen großen Wertebereich erlaubt sogar eine genaue Auswertung von Assays in hohen Konzentrationsbereichen, was bei den meisten Photometern nicht gegeben ist.

Das fluidlab besitzt zudem die einzigartige Möglichkeit eine Live-Beobachtung des gesamten Spektrums durchzuführen, wobei die Extinktion der gemessenen Substanz auch bei anderen Wellenlängen angezeigt wird.

Zusätzlich bietet das fluidlab R-300 eine Kinetik-Applikation, um automatisch Extinktionsmessungen über verschiedene Zeitintervalle durchzuführen.

^{Wissenschaftliche Quellen}

¹Mayerhöfer, T. G., Pahlow, S., & Popp, J. (2020). The Bouguer-Beer-Lambert Law: Shining Light on the Obscure. Chemphyschem: a European journal of chemical physics and physical chemistry, 21(18), 2029–2046.

²Schoenberg, E. (1929). Theoretische Photometrie. Grundlagen der Astrophysik. Handbuch der Astrophysik, Springer, Berlin, Heidelberg, 2, 1-280.

³Abitan, H., Bohr, H., & Buchhave, P. (2008). Correction to the Beer-Lambert-Bouguer law for optical absorption. Applied optics, 47(29), 5354–5357.

⁴Proske, O., Blumenthal, H., Ensslin, F. (1953). Photometrie. Analyse der Metalle. Springer, Berlin, Heidelberg, 2, 1228–1240.

⁵Da Costa, G. S. (1992). Basic photometry techniques. In Astronomical CCD Observing and Reduction Techniques, 23, 90-102.

⁶Rugg, F. M., Calvert, W. L., & Smith, J. J. (1951). The Design and Performance of a Double-Beam Infrared Spectrophotometer. JOSA, 41(1), 32-38.

⁷Arnemann, J. (2019). DNA-/RNA-Konzentrationsbestimmung: Lexikon der Medizinischen Laboratoriumsdiagnostik. Springer Reference Medizin. Springer, Berlin, Heidelberg, 1, 719 ff.

⁸Buchholz, K. (1989). Immobilisierte Enzyme–Kinetik, Wirkungsgrad und Anwendung. Chemie Ingenieur Technik, 61(8), 611-620.

⁹Frenzel, W. (2015). Photometrie: Einsatzmöglichkeiten in der Umweltanalytik, Wiley Analytical Science, https://analyticalscience.wiley.com/do/10.1002/gitfach.14006 [05.04.2022].

¹⁰Berndt, V., Ottleben, I. (2017). Die Wasserqualität anforderungsgerecht mittels Photometrie prüfen, Laborpraxis, https://www.laborpraxis.vogel.de/die-wasserqualitaet-anforderungsgerecht-mittels-photometrie-pruefen-a-590075/ [05.04.2022].

¹¹Willard, H.H., Furman, N.H., Grubitsch, H. (1950). Kolorimetrische Analyse: Grundlagen der quantitativen Analyse.Springer, Wien, 1, 375–382.