Färbungsfreie Viabilitätsbestimmung von Zellen mit dem fluidlab R-300

Das fluidlab R-300 verwendet die färbungsfreie Technik der digitalen holographischen Mikroskopie (DHM), um Zellzahl und Lebensfähigkeit direkt in der Zellkulturumgebung zu analysieren. Im Gegensatz zur Hellfeldmikroskopie verwendet DHM keine optischen Linsen, sondern erzeugt so genannte "Hologramme" der Zellen, die von einem Computer analysiert werden. Wichtig ist, dass diese holographischen Bilder Informationen sowohl über die äußere Zellmorphologie als auch über die zytoplasmatische Zusammensetzung enthalten, die auf Unterschieden in den Brechungsindizes der Zellstrukturen beruhen. Diese Eigenschaft macht die DHM-Bildgebungstechnologie für empfindliche Messungen verschiedener zellulärer Ereignisse wie den Zelltod geeignet.

Was ist digitale holographische Mikroskopie?

Digitale holographische Mikroskopie (DHM) ist eine hochmoderne quantitative Phasenbildtechnik, die eine automatisierte färbungsfreie Bestimmung der Zellzahl und Lebensfähigkeit dieser ermöglicht. Bei der DHM wird die Probe mit Licht beleuchtet. Ein Teil des Lichts wird, entsprechend seines Brechungsindex, durch die Probe gebeugt, während ein anderer Teil durch die Probe hindurchgeht, ohne sie zu "sehen". Nach der Probe interagiert das gebeugte Licht mit dem nicht gebeugten Licht, wodurch ein Hologramm entsteht, wenn es auf die Kamera trifft. Das Hologramm wird dann digital rekonstruiert, um ein Bild zu erhalten. Dieses Bild enthält wertvolle Informationen über die Zellkulturprobe, wie z.B. die Integrität der Membran und den Proteingehalt.

Was ist der Unterschied zur Standard Hellfeldmikroskopie (Brightfield)?

Bei der Hellfeldmikroskopie werden Linsen verwendet, um Bilder zu erzeugen, die auf der Absorption von Licht durch die Probe basieren. Viele biologische Proben sind von Natur aus farblos und kontrastarm, da sie nur wenig Licht absorbieren. Um den Kontrast zu erhöhen, verwenden Forscher oft Farbstoffe, um ihre Probe mit der Hellfeldmikroskopie sichtbar zu machen. Bei der DHM, die ganz ohne Linsen auskommt, werden Bilder auf der Grundlage des Brechungsindex der Probe erzeugt. Der Brechungsindex einer biologischen Struktur bestimmt die Art und Weise, wie diese mit Licht interagiert. Er enthält Informationen über den optischen Dichteunterschied an Grenzflächen wie z.B. verschiedenen Membranen oder proteinreichen Kompartimenten. Aus diesem Grund hat ein holografisches Bild mehr Informationsgehalt als ein Hellfeldbild mit vergleichbarer Auflösung. Diese Information ist jedoch für das menschliche Auge nicht immer leicht interpretierbar. Deshalb verwendet das fluidlab R-300 Convolutional Neural Networks (CNNs), um zelluläre Zustände wie den Zelltod zu klassifizieren.

Wie kann Zelltod mit DHM sichtbar gemacht werden?

Zelltodprozesse gehen mit dramatischen Veränderungen der Zellmorphologie einher, z.B. Volumenänderungen und Fragmentierung. In-vitro-Assays unterscheiden typischerweise zwischen lebensfähigen und nicht-lebensfähigen Zellen, indem die Membranintegrität durch Hinzuführen von Farbstoffen wie Trypanblau beurteilt wird. Allerdings kann die Zellfärbung nach langer Exposition zu zytotoxische Effekte gegenüber dem Reagenz führen, was zu fehleranfälligen Schätzungen der Zelllebensfähigkeit führt.

Im Gegensatz dazu hebt die färbungsfreie DHM-Technik die morphologischen und strukturellen Veränderungen hervor, die während des Zelltods auftreten. Qualitativ zeichnen sich lebende Zellen durch eine dunkle Kontur, die der intakten Zellmembran ähnelt, und ein helles, strukturiertes Zytoplasma aus. Tote Zellen erscheinen stattdessen zunächst als dunkle Objekte, die später aufgrund von Prozessen wie Membranfragmentierung, Karyolyse (Fragmentierung der Kernmembran) und Auslaufen des Zytoplasmas den Kontrast und eine klar definierte Abgrenzung verlieren.

Wie analysiert das fluidlab R-300 die Zelllebensfähigkeit?

Das fluidlab R-300 verwendet kontrollierte Algorithmen des maschinellen Lernens (CNN), um alle Zellen innerhalb des Bildes auf Grundlage ihrer Morphologie zu erkennen und zu zählen. Darüber hinaus wird jede Zelle von einem CNN analysiert, um den Zustand der Zelllebensfähigkeit zu bestimmen. Die Bestimmung der Zellviabilität mit DHM beruht auf einem Signal, das proportional zum intrazellulären Brechungsindex sowie zum Membrankontrast ist. Das fluidlab R-300 unterscheidet zwischen drei Klassen: lebende, tote und so genannte "nicht-interpretierbare" Zellen. Nicht-interpretierbare Zellen sind Zellen, die sich scheinbar anders verhalten oder die vom CNN nicht mit hoher Sicherheit analysiert werden konnten. Diese dritte Zellklasse wird weder in die Gesamtzellzahl noch in die Bestimmung des Viabilitätsverhältnisses einbezogen.

Am Ende der Analyse werden der Prozentsatz der lebensfähigen Zellen in der Probe und die absolute Anzahl der toten und lebenden Zellen angezeigt. Darüber hinaus werden die Zellen in Boxen (farblich als lebende und tote Zellen gekennzeichnet) im rekonstruierten holographischen Bild angezeigt. Ein Histogramm zeigt die Anzahl der lebenden und toten Zellen in Abhängigkeit von ihrer Größe. Es ist möglich, den Größenbereich manuell so anzupassen, dass nur Zellen einer bestimmten Größe in die Analyse einbezogen werden. Es ist zu erwarten, dass die durchschnittliche Größe der Population lebender und toter Zellen aufgrund von Schrumpfungseffekten und anderen Veränderungen der Morphologie besonders stark variieren kann. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das fluidlab R-300 eine färbungsfreie Bestimmung der Zellviabilität genauso effizient und präzise wie Standardfärbetechniken ermöglicht.